Effettuiamo campionamenti per ricerca e quantificazione Legionella con tecnica PCR Real Time, certificati da laboratorio accreditato, con conteggio quantitativo delle unità genomiche in meno di 24 ore.
I metodi tradizionali per la ricerca di Legionella spp e Legionella pneumophila in campioni di acqua hanno lo svantaggio di possedere un lungo periodo di incubazione. La ricerca delle stesse con il metodo PCR consente invece di ottenere risultati in tempi brevi e con una maggiore sensibilità.
Questi metodi consentono il rilevamento e/o la quantificazione di Legionella spp. e di Legionella pneumophila in tutti i campioni di acqua in poche ore, nelle quali si svolgono le seguenti fasi:
1. Filtrazione del campione
2. Estrazione del DNA
3. Reazione PCR per il rilevamento di Legionella spp. e Legionella pneumophila
Il test in PCR è basato sull’amplificazione e il rilevamento di sequenze genomiche di un DNA target che funge da bersaglio, in questo caso quello della Legionella. Durante la prova, i primer (cioè filamenti di acido nucleico che servono come punto di innesco per la replicazione del DNA) si legano in una regione target del batterio e la Taq polimerasi utilizza questi primer e i deossinucleotidi trifosfati (dNTP) per estendere il DNA, creandone copie esatte (definite ampliconi). Successivamente, una sonda oligonucleotidica si ibrida a questi ampliconi ed emettendo fluorescenza, grazie ad un fluoroforo in suo possesso, consente di “vedere” la presenza di DNA del batterio.
Quando il DNA bersaglio è presente nel campione, l’intensità della fluorescenza aumenta proporzionalmente all’aumento della quantità dei prodotti amplificati e viene misurata dal modulo ottico all’interno del termociclatore durante la fase di ibridazione. Il software combinato con lo
strumento visualizza in tempo reale l’intensità della fluorescenza in base al numero di cicli di amplificazione. Per ogni reazione, il software determina un Cq, cioè il ciclo da cui la fluorescenza aumenta significativamente al di sopra del rumore di fondo. Il valore di Cq è correlato al logaritmo del numero di copie iniziali della sequenza bersaglio.
La lettura dei valori di Cq consente di rilevare la presenza del DNA del batterio della Legionella e ciò è rappresentativo della presenza del DNA nel campione d’acqua originale. La quantificazione è possibile grazie alla interpolazione dei risultati ottenuti con una curva creata appositamente utilizzando standard contenenti vari quantitativi di batterio. L’utilizzo di un reagente specifico consente di eliminare la parte di DNA non vitale permettendo di identificare e quantificare solo la componente viva.
Operazione in conformità alla ISO/TS 12869 (Novembre 2012): Water quality – Detection and quantification of Legionella spp. and/or Legionella pneumophila by concentration and genic amplification by quantitative polymerase chain reaction (qPCR).